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NanoDrop One/OneC严格质控核酸样品保证RT-qPCR实验成功

版权所有,转载请联系基因市场部
2021-07-08

       在RT-qPCR反应中利用荧光强度达到阈值时所需的循环数Cq可以对初始模板RNA进行定量,从而比较不同样品间基因表达水平的差异或用于临床上感染性致病源的核酸检测。而RNA纯化的过程很容易残留多种污染物(如基因组DNA、蛋白质、苯酚等有机溶剂),这些污染物会通过虚假提高核酸浓度测定值、抑制逆转录酶/聚合酶活性、破坏核酸样本等途径影响最后的实验结果。因此RT-qPCR前对核酸样品浓度和纯度进行质控至关重要。

       MIQE(Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments)指南中规定了RT-qPCR实验数据发表所必需的最少实验信息:包括RNA浓度、纯度、污染物等信息。其中NanoDrop是该指南提名推荐的进行RNA样品质控方法之一。

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NanoDrop 严格质控RNA样品

  • NanoDrop One/OneC仅需1-2μl样品上样,即可在8s内完成2-27500ng/ul核酸样品浓度、纯度测定;

  • Acclaro?智能样品分析技术可以识别核酸样品中的常见污染物(蛋白质、苯酚、胍盐、其它核酸等),更好地帮助实验者进行RT-qPCR前核酸样品的质控;

  • Acclaro?智能样品分析技术较A260/A280、A260/A230纯度比值评估样品纯度更灵敏和准确。

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02

污染物对RT-qPCR结果的影响

1、有机溶剂污染

       当RNA样品中有苯酚、TRIzol等有机溶剂污染时,这些有机溶剂会使逆转录酶和聚合酶变性,提高Cq值导致假阴性结果。

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使用NanoDrop One/OneC可以在质控时提示污染物类型,并可以通过改变样品上样量对下游RT-qPCR实验结果进行有效修正。

2、DNA污染

       如果RNA和DNA分离不彻底使得RNA样品中混有基因组DNA时,会虚假提高样品浓度测定值,进而减小RNA初始上样量使得下游RT-qPCR结果Cq值变大。但是当基因组DNA序列和cDNA序列一致时,两者结合引物的能力是相同的,DNA的共扩增会使得Cq值变小,导致错误的实验结果。

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在对RNA样品质控时,NanoDrop One/OneC可以检测出DNA污染,当DNA含量较低时可通过调整模板上样量修正PCR结果;但是当混入DNA含量高于50%,由于初始模板RNA量很小,可能40个PCR循环后反应体系内荧光强度仍无法达到阈值,导致出现错误的PCR结果。

3、蛋白质污染

       在提取核酸时,很容易从组织中引入蛋白质污染,蛋白质的存在会抑制聚合酶活性从而降低检测灵敏度或者产生假阴性结果。

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如果蛋白污染物消光系数较小(如BSA等),NanoDrop One/OneC可以在质控时提示污染物类型,并可以通过改变样品上样量对实验结果进行有效修正。但是污染物消光系数过高(如Hemoglobin等蛋白质污染)将不能触发Acclaro校正功能,无法对下游实验进行有效修正。

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如何去除各种污染物

1、如果NanoDrop One/OneC鉴定出RNA样品中有苯酚、蛋白质污染,可以在RNA提取时重复苯酚-氯仿抽提过程并在分离时进行细致的移液操作;

2、如果鉴定出RNA样品中有胍盐污染,可以重新用异丙醇或乙醇沉淀RNA以达到去盐的效果;

3、而当RNA样品中有DNA污染时,实验者可以采用DNase、氯化锂沉淀、重新进行苯酚-氯仿抽提等多种方法来去除DNA污染。

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欢迎试用

     基因有限公司做为NanoDrop家族的全国性代理商,热烈欢迎各位老师们的试用申请。可以扫以下二维码与产品经理申请,也可以直接联系您身边的销售人员。

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